La spectrophotométrie est une technique de laboratoire courante pour déterminer la concentration en soluté dans une solution. Un spectrophotomètre utilise un prisme ou un réseau de diffraction pour sélectionner la lumière d’une longueur d’onde désirée et la faire passer à travers l’échantillon d’essai. Un détecteur de l’autre côté mesure l’intensité de la lumière qui la frappe. La mesure donne le pourcentage de transmittance et d’absorbance lorsque l’instrument est correctement calibré. Après avoir mesuré l’absorbance, trouver la concentration est un calcul simple qui repose sur une formule appelée loi de la bière.
Ecrire l’équation suivante : Absorbance = (absorptivité) * (longueur) * (longueur) * (concentration). Cette formule s’appelle la loi de la bière. Vous connaissez l’absorbance de votre expérience, tandis que la composante de longueur est la distance à travers la « cuvette » – le récipient utilisé pour contenir l’échantillon dans le spectrophotomètre. Pour la plupart des cuves, la distance est de 1 cm, bien que vous devriez le vérifier. Enfin, l’absorptivité molaire est une constante spécifique à une substance, un solvant et une longueur d’onde donnés. Calculez l’absorbance molaire à l’aide de l’absorbance des solutions étalons que vous avez mesurées dans votre expérience.
Entrez l’absorbance et la concentration d’au moins cinq échantillons standard utilisés dans votre expérience. Ces échantillons standard ont une concentration connue, vous pouvez donc les utiliser pour trouver l’absorptivité molaire. Sauter cette étape si vous travaillez avec une molécule comme l’ADN dont l’absorptivité molaire à 260 nm est déjà connue. Pour l’ADN, vous pouvez utiliser le calculateur dans la section « Ressources » ci-dessous.
Utilisez le programme graphique pour représenter graphiquement les données de votre tableau avec une concentration sur l’axe des x et une absorbance sur l’axe des y. Dériver une ligne de la meilleure adéquation pour ces données en utilisant le programme ; cette équation devrait être linéaire. La procédure précise variera selon le programme graphique que vous utilisez ; consultez le guide de l’utilisateur pour votre tableur ou l’aide en ligne si nécessaire.
Branchez la valeur d’absorbance de votre inconnue dans l’équation de la ligne du meilleur ajustement de votre graphique et résolvez la concentration. Alternativement, si vous avez affaire à une molécule comme l’ADN dont l’absorptivité molaire à une longueur d’onde donnée est déjà connue, branchez l’absorbance dans la formule de la loi de la bière que vous avez écrite. Diviser l’absorbance par la longueur et par la constante d’absorbance molaire. Cette opération vous donnera la concentration en moles par litre.
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